助力生物制药与疫苗生产迈向真正的一次性工厂

cnvax 2016-12-22 • 1人收藏 • 375人看过

在过去10年中,用于哺乳动物细胞和昆虫细胞培养的一次性生物反应器已在临床前,临床和生产规模的生物制药工厂广泛采纳。在这样的生物反应器操作过程中,工艺参数的监控对确保生物制品或者疫苗的关键质量属性(CQAs)符合安全产品的生产要求至关重要。传统上,袋式和台式反应器配有不锈钢或台式生物反应器相似的传统pH和溶氧(DO)电极,因为DO和pH值是受实时监测最基本的物理化学参数。对于许多工艺而言,pH值的测量和控制非常重要,因为小小的偏差便可能影响培养细胞的生长与代谢,尤其是葡萄糖的消耗和乳酸的生产。DO必须监测和控制的原因是为了防止氧气浓度发生改变,否则会导致乳酸的过量生产,抗体糖基化降低,或产生细胞毒性。

可重复使用的传感器通常采取独立校准方式,安装在电极组件内,经高压灭菌,而后通过无菌连接器连接至一次性袋子。这种手工任务不仅费时,还会削弱一次性生物反应器的许多优势,甚至可能会引入污染。

图1 不同规模的一次性生物反应器,带有集成的一次性pH和DO传感器:(从左至右)来自Sartorius Stedim Biotech的UniVessel® SU,Biostat® RM 20及Biostat® STR 2000系统 Biotech

一次性传感器为使用一次性生物反应器的科学家提供了许多优点:降低污染风险,免除清洗、验证、灭菌以及电极校准等步骤。尽管一次性传感器拥有如许多的优势,但生物制药行业却不如接受一次性生物反应器那样很快地接受它们。其中一个原因便是与传统的电极相比,光学pH传感器存在着辐照、漂移和使用寿命等稳定性问题。此外,也鲜有不同规模的一次性生物反应器配备这些类型的传感器。

本文描述了赛多利斯斯泰帝生物技术有限公司的应用于不同规模的一次性生物反应器上的集成式一次性传感器组件。这些传感器的设计能够确保稳健的性能,可以媲美传统电极。案例研究表明,在真正的大规模细胞培养中,可运行至高达1000-L的规模。一次性传感器在设计和性能方面的先进性可以使生物制药行业向全面一次性生产质量稳定的生物制品的目标更进一步。

集成式设计

为了集成至一次性生物反应器,光学一次性传感器必须要被设计为能够安装在一次性工艺袋或容器内,而且可以辐照。同时,它们必须要在经受辐照之后仍能轻松校准,还要保持功能精确。本文中所描述的为了集成至一次性生物反应器而设计的光学传感器,是基于荧光和发光原理对pH值和DO进行测量,这些都是在细胞培养中用于测定参数的行之有效的方法。当装配于一次性生物反应器时,这些传感器会被连接到放大器上,将某一特定波长的透射光传输至传感器斑点上。在该斑点上的荧光染料被正弦调制光激发,使pH值或O2依赖性的发光强度通过从激发状态到荧光信号的相移而被捕获。

表1总结了Sartorius Stedim一次性生物反应器中所使用的光学一次性DO和pH电极(来自PreSens Precision Sensing GmbH)的主要特征。DO和pH的斑点被固定于一次性袋子或容器的内表面上,从而使这两个参数均能以非侵入的方式从外部穿透聚合物壁进行测量。这种方式免除了污染的风险,因为该传感器在灭菌之前便已被安装于生物反应器之中。一次性DO传感器相对于传统可重复使用的玻璃Clark电极而言具备更多的优势,因为它不需要电解质。这一特点显著缩短了平衡时间,因为通过使集成的一次性生物反应器和传感器在安装时随时可用细胞培养基进行校准,这就极大地节省了使用时间。

可放大性能

为了实现生物制剂和疫苗生产工艺的无缝放大,一次性传感器需要被集成至实验室、中试以及生产规模的生物反应器中。这样便可降低细胞培养参数因不同测量原理导致差异所带来的风险。它可使工艺开发和生物制剂的生产无论是何种规模,在整个产品的生命周期内都能具有始终如一的CQAs,从而让工艺无需耗时的额外研究就能实现无缝放大和转移。

传感器斑点常常必须要安装于不同位置,并采用不同的连接方式以对pH值和DO进行最佳测量,这取决于生物反应器的设计及材料,和/或细胞培养混合的类型(图1)。例如,在刚性搅拌式2-L一次性UniVessel® SU生物反应器上,一次性传感器的斑点被集成在容器底部,直接通过无光束光电技术读取结果。在摇摆式的Biostat® RM系统中,传感器以管路的方式安装,通过柔韧的光纤读取结果。在Biostat® STR生物反应器中,传感器集成进入传感器端口,该端口可在伽马射线的辐照过程中对它们起到保护作用。所有Biostat® STR工艺袋均可再配备一对传感器作为备用,这样设计的生物反应器可满足《药品生产质量管理规范》(GMP)生产的要求。

集成式一次性传感器的准备

灭菌:为了制造完全集成的,即用的,且品质如一的一次性生物反应器和传感器,所有组件必须要以独立的无菌单元的形式提供。如此,生物工艺科学家便可马上使用集成的生物反应器,而无需再另外安装传感器,从而杜绝引入污染的可能性。γ和β辐照是一次性生物反应器的常规灭菌方法。但是,一次性pH传感器可能会因γ或β光束辐照后在周围空气中产生的酸性气体和氧而受到影响。这会导致传感器斑点中染料的失活(尤其是pH染料)。当生产集成的生物反应器和pH传感器组件时,需要采取措施来保护传感器斑点免受组件中残留空气的影响。例如,Biostat® STR搅拌式系统包含内部搅拌器和通气口,能防止袋子折叠变平从而产生空气残留空间。

高度专业化设计的传感器端口可在这些容器接受辐照期间有效保护传感器(图2)。它有一个闭合(用于辐照,储存)位置,可将传感器与空气隔离,还有一个工作位置使其能与袋腔接触。相比之下,摇摆式一次性生物反应器可以平置,仅残留临界空气体积,因而无需采取额外的措施在辐照期间保护它们。与此类生物反应器相似, UniVessel® SU容器中的残留空气量也非常小,所以光学传感器不受影响。另外,UniVessel® SU生物反应器采用β-辐照,这是一种温和的灭菌方式。

伽马辐照并非单独影响一次性pH电极的性能。图3展示了光学pH传感器可重现的、一致的pH测量结果,该传感器曾接受了大范围的辐照剂量。数据表明,将一次性传感器和生物反应器一起灭菌是可行的,这样便提供了一个完全无菌的功能性组件,可以随时用于安装。

校准:从大约1 000斑点的每一个批次中,用规定数量的、经过辐照的传感器来生成校准值。这是常规质量控制(QC)的一部分,以确保每批传感器符合严格的质量验收标准。一个完整的质量管理体系,应能确保所有生产步骤的全程追溯,包括原材料批次,中间体和传感器组件等等。

一次性PreSens pH传感器的校准包括四个校准参数,近似于S形校正函数:rmin,rmax,dpH和pH0根据波尔兹曼方程(图4)通过曲线拟合进行推算。对于一次性PreSens DO传感器的校准,氧浓度和发光寿命之间的相关性由Stern-Volmer方程(图5)来表示。因为氧气和发光成正比,所以只有在100%和0%两个空气饱和度所测量的值才是校准所必需。

为某一特定的细胞培养工艺校准一次性pH传感器,需要在培养基达到某个温度和CO2平衡之后进行单点校准。这个步骤必须要进行,因为细胞培养的培养基和对照系统之间存在差异,而必须要用对照系统来确定校准参数。建议每天离线取样用于pH测量,以确定偏差是否超出规定的标准,一般pH单位为0.1。如果发生偏差,那么一次性pH传感器应重新校准。

当培养基的离子强度被改变(例如,通过加入碱来控制pH)时,也应进行校准。图6说明了当离子强度的变化范围在50~200 mM时造成了校准曲线的漂移,这一范围在哺乳动物细胞培养工艺和相关的补料工艺中是最常见的。

离子强度即溶液中离子总量电场强度。它们会影响电解质导电率。通过比较,摩尔渗透压测量的是溶液中渗透活性物质总量,它所代表的不仅是离子,还代表碳水化合物和蛋白质等并不影响培养基离子强度的一些物质。

操作注意事项:光学传感器的荧光染料对光非常敏感。暴露于强光之下可能会对传感器造成不可逆转的破坏,使它们无法使用。因此带有集成光学传感器的生物反应器必须要储存在避光的包装内直至生物工艺的启动,以使光线造成的影响降至所有Sartorius Stedim Biotech一次性封闭容器设定的最低值。在操作过程中,用户应尽量减少将光学传感器直接曝露于光源的机会。

稳定性:一次性传感器的保存期限已经确定为伽马辐照前两年和伽马辐照后最多3年。因而在被集成组装至一次性生物容器之前,传感器最多可保存2年,而在伽马辐照之后最多可保存3年。一在严格的验收标准下,一次性传感器能在3年内保持其参数(图7),因此稳定性将不再是一次性生物反应器的使用寿命的限制因素。

案例学习:在缓冲液系统中的长期稳定性

作为将光学传感器应用到不同的一次性生物反应器的任务之一,我们进行了详细的性能测试。首个实验是在37 ℃, 150 mM的离子强度下,每分钟测量缓冲液系统的pH值,持续>11天(图8)。采用传统的pH电极(Hamilton easyferm)作为对照,使用赛多利斯的台式pH计测量pH对照值。pH电极保存于于氯化钾溶液中(3M,KCl),并在每一次单次测量之前均重新校准。

140 h后,我们用1 M,NaOH溶液将pH值从6.7调节至7.3,并重新校准光学一次性传感器。约200h后,光学一次性pH传感器和参比pH电极之间的偏差<0.03个pH单位。这相当于12.000单个测量点,或是270h<0.1个pH单位,16.000的单个测量点。这项测试证明了与带有缓冲液系统的pH电极以及传统台式pH计相比,一次性 pH传感器具有长期稳定性和精确性。

案例研究:细胞培养

在细胞培养中,pH控制对于维持最佳生长和代谢而言非常重要。使用中国仓鼠卵巢(CHO)和其它哺乳动物细胞系无需频繁测量pH值,因为它们的生长和代谢比微生物培养缓慢,pH值往往只会发生典型且简单的阶段性变化。所以每分钟的测量频率仍能有效提供了充分的数据用于稳健的控制回路。光学pH传感器在使用寿命期间能够读数≥20 000次。以该测量频率,能够实现在培养过程中超过14天进行连续测量,而不会对性能造成明显的破坏(图9)。

集成到Biostat® STR 50和1 000袋子的一次性pH传感器表现出了与在线或离线pH电极较吻合的结果,就如超过17天的50-L和1000-L流加CHO细胞培养物所显示的结果一样 (图10和11)。本公司的研究结果表明,集成的一次性pH传感器是可靠且稳健的,能为整个细胞培养运行期间的pH监测提供了一个可放大的方法。

小结

在生物工艺应用中,一次性传感器相较于传统的在线和离线电极而言,能够提供一致且精确的测量结果。集成有光学一次性传感器的一次性生物反应器有不同规模(从15 mL~2 000 L不等)可供使用。光学电极根据它们所集成的一次性生物反应器的类型不同,分别对灭菌方式与设计进行了优化。这使得每次细胞培养的运行期内都能够实现电极稳健的测量性能。一次性传感器为工艺开发科学家提供了优良的在不同规模的数据可比性:从工艺开发和特征研究的的小试硬质罐到一直到用于临床和商业化生产的2000-L袋式生物反应器。只要光学传感器被保护免受光线直接破坏,简单易用的一次性传感器便很容易操作与校准,且能提供精确的测量数据。将这样的传感器集成至一次性生物反应器,便可建立一个独立的,无菌的密封单元,进而能够方便、快速地应用于自动化控制系统。由于无需另外安装重复使用的电极,从而避免了生物反应器受到污染。

强大的集成式一次性传感器和生物反应器的成功开发,促使生物制药行业向完全一次性的自动化工厂迈近重大一步,最终实现生物制品与疫苗安全而有效的生产。


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